Organización de la comunicación con el Laboratorio de Microbiología. Traslado de muestras. Técnicas de diagnóstico rápido. Formación continuada en la toma/descripción de las muestras para pruebas ...
3.1. Técnicas de diagnóstico directo a partir de sangre
Pese a que los hemocultivos continúan siendo el procedimiento diagnóstico de referencia, estos cuentan con algunas limitaciones. En primer lugar requieren mucho tiempo de trabajo y son relativamente lentos en cuanto a la obtención de resultados. A esto se suma que solo detectan microorganismos viables y muestran una baja sensibilidad en determinados microorganismos de crecimiento lento, intracelular o cultivo difícil. Además, la tasa de positividad general puede ser tan baja como 30-40% a pesar de la correcta implementación de los procedimientos estándar en cuanto a la recogida de volumen de sangre adecuada (7).
Estos puntos débiles del hemocultivo han sido subsanados al menos parcialmente por las técnicas moleculares. Todas las técnicas moleculares disponibles en la actualidad se basan en un procedimiento similar: la lisis, extracción y purificación de ácidos nucleicos del microorganismo, la amplificación de ácidos nucleicos por PCR y finalmente su identificación por diversos métodos como la hibridación basada en ELISA, la detección en tiempo real mediante fluorescencia o empleando microarrays.
Debemos tener en cuenta que estas muestras no están exentas de limitaciones. Entre ellas, los falsos positivos causados por la persistencia en la circulación sanguínea de ADN procedente de microorganismos muertos o la interferencia en la determinación por la existencia de gran cantidad de ADN humano, así como ADN potencialmente contaminante. El segundo inconveniente es el bajo número de microorganismos circulantes en la sangre en un episodio de bacteriemia y que se estima entre 1 y 10 UFC/ml y que puede favorecer la existencia de falsos negativos.
A continuación describiremos brevemente las principales técnicas moleculares (tabla 3)(8):
| Sistema | Técnica | Tº para resultados (horas) | Volumen de sangre (ml) | Microorganismos identificados | Marcadores de resistencia y virulencia | Sens., Espec. y correlación con métodos convencionales (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| SepsiTest | PCR + secuenciación | 6 | 1-10 | >345 bacterias (Gram+, Gram-) y hongos | 0 | 21-87, 85-96, ND |
| Septifast | PCR en tiempo real | 3,5-5 | 1,5 | 6 Gram+, 8 Gram-, 5 Hongos | mecA | 43-95, 60-100, 43-83 |
| Magic Plex | PCR Multiplex + PCR tiempo real | 3-5 | 1 | 21 bacterias (Gram+, Gram-) y 6 hongos | mecA, vanA/B | 37-65, 77-92, 73 |
| VY00 | PCR Multiplex + electroforesis | 8 | 5 | 32 bacterias (Gram+, Gram-) y 7 hongos | 0 | ND, ND, 70 |
| PLEX-ID | PCR/ESI-MS | 6 | 1.25-5 | Hasta 800 patógenos (Gram+, Gram- y hongos) | mecA, blaKPC, vanA/B | 50-91, 98-99, 79-97 |
| T2 Biosystems | PCR Multiplex + sensor nanoparticulas paramagneticas | 3-5 | 2 | 6 bacterias (2 Gram+, 4 Gram-) y 5 hongos | 0 | 91.1, 99.4, ND |
Adaptado de Candel FJ. Et al. Rev Esp Quimioter. 2018 Aug;31(4):298-315.
LightCycler SeptiFast: Permite detectar e identificar directamente a partir de la sangre 25 agentes patógenos. Es capaz de detectar el gen mecA, responsable de la resistencia a la meticilina. Solo requiere 1,5 ml de sangre completa y el proceso de detección tiene una duración de 3,5 a 6 h. En una revisión sistemática de 41 estudios que valoraron la precisión diagnóstica comparando SeptiFast con el hemocultivo estándar, la sensibilidad fue del 68% y la especificidad, del 86%.
Magicplex Sepsis Real-Time: permite identificar más de 90 microorganismos incluyendo 73 microorganismos grampositivos, 12 gramnegativos, 6 hongos y 3 genes determinantes de resistencia (vanA, vanB y mecA). Solo es necesario un volumen de sangre de 1 ml y el resultado final se puede obtener en 3-6 h. Al igual que en el caso del Septifast los estudios que han testado su funcionamiento en comparación con el hemocultivo han logrado porcentajes elevados de especificidad (entre 85-95%) pero valores mejorables de sensibilidad que según las series oscilan entre el 21% y el 81%.
Sistema VYOO: se trata de una técnica semiautomática que emplea una PCR múltiple que permite identificar 34 bacterias y 7 hongos. Son necesarios 5 ml de sangre, y el resultado final se obtiene en 7 h. La identificación se realiza mediante tecnología de microarrays y el límite de detección teórico es de 3-10 UFC/ml. Los genes de resistencia determinados son: mecA, vanA, vanB, así como genes de betalactamasas de espectro extendido (BLEE): blaSHV y blaCTX-M. Respecto a su aplicación clínica, los resultados obtenidos son variables si bien cabe destacar que en algunos estudios el sistema VYOO fue más sensible que los hemocultivos. Esta mayor sensibilidad podría deberse a su bajo límite de detección (3-10 UFC/ml), asociado con un volumen de sangre más elevado (5 ml). Entre las limitaciones de la técnica destacar que implica varios pasos manuales lo cual implica una mayor complejidad de uso y riesgo de errores de detección.
Septitest: Permite la identificación de 345 agentes patógenos entre bacterias y hongos, y el límite de detección es de 20-460 UFC/ml. El volumen de sangre necesario es de 1 ml y además de en sangre puede utilizarse en otros líquidos estériles. El proceso requiere 4 h para saber si hay algún agente etiológico presente en la muestra y 4 h más hasta conocer el resultado de la secuenciación. Los resultados de diversos trabajos publicados indican que la sensibilidad y la especificidad son muy variables, entre el 21 y el 85% y el 58 y el 95%, respectivamente. Además, el sistema carece de la detección de genes de resistencia.
Sistema PCR/ESI-MS (PLEX-ID): permite identificar cerca de 800 microorganismos y es capaz de informar sobre la presencia de 4 genes de resistencia (mecA, vanA, vanB y blaKPC). El volumen de sangre necesario es de 5 ml y el tiempo requerido es de 6 h. El límite de detección del sistema para bacterias es de 16 UFC/ml, y de 4 UFC/ml para Candida. Tiene la capacidad de detectar bacteriemias polimicrobianas, y también puede aplicarse en otras muestras diferentes de la sangre, como líquidos estériles, o en el diagnóstico de infecciones respiratorias, ampliando el número de microorganismos identificados a casi 1.000 entre bacterias, hongos y virus. Aunque se trata de una técnica sumamente interesante por el elevado número de potenciales patógenos identificables y su aplicabilidad a diferentes tipos de muestras el número de estudios que la avalen es limitado. De hecho, los 2 trabajos publicados en la actualidad han reportado cifras de sensibilidad de en torno al 80% pero con especificidades muy variables (69% frente a 94%).
Sistema T2dX: combina el empleo de sensores de nanopartículas paramagnéticas con la detección de ellos por la resonancia magnética nuclear T2. Permite la detección de patógenos en sangre con una sensibilidad muy alta (> 95%). Es capaz de detectar patógenos a niveles extremadamente bajos del tipo de una célula por ml de sangre. Es capaz de identificar un número limitado de microorganismos. Se trata de una técnica prometedora que requiere de trabajos que la testen en la práctica clínica.